Primer5入門級(jí)引物設(shè)計(jì)攻略_飛外網(wǎng)

Primer5是分子生物學(xué)常用的引物設(shè)計(jì)軟件,準(zhǔn)確率高,操作性強(qiáng),下面小編就如何利用Primer5進(jìn)行引物設(shè)計(jì)分享自己的心得,本篇較簡單,適合初學(xué)者。

操作方法01

獲取引物模板引物與模板一一對(duì)應(yīng),設(shè)計(jì)引物之前先要找到一段匹配的模板。以H9禽流感病毒HA基因?yàn)槔?,在NCBI上下載一個(gè)最新的病毒HA基因作為本經(jīng)驗(yàn)所介紹的引物設(shè)計(jì)的模板。

02

新建打開Primer5(小編的版本為英文版),依次點(diǎn)擊“file”——“new”——“DNA Sequence”,新建操作界面。

03

輸入模板基因復(fù)制基因模板后,使用鍵盤快捷鍵“Ctrl+V”將下載的引物模板粘貼到空白框內(nèi),然后選擇“As is”,點(diǎn)擊“OK”。

04

Search Primer找到界面左上角“Function”——“?Primer”,在新跳出的界面上點(diǎn)擊“Search”,需要設(shè)置相應(yīng)的條件,才能開始搜索。

05

條件設(shè)置點(diǎn)擊“Search”后,又跳出一個(gè)界面,我們從上到下依次設(shè)置:“Search For”選擇“PCR Primers”;“Search Type”選擇“Pairs”;“Search Ranges”要根據(jù)不同的情況而定,一般來說選擇基因全長,如“1”——“1683”;“PCR Product Size”一般鑒定選擇300-500,測序選擇1200-1600,不能超過基因全長;“Primer Length”一般為20+(-)2。

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點(diǎn)擊兩次“OK”條件設(shè)置完畢后,點(diǎn)擊“OK”,跳出新的界面后再點(diǎn)擊“OK”,最后跳出軟件為你選擇的按照合成率從高到底的全部引物序列。

07

引物選擇將引物表與左側(cè)表格結(jié)合起來進(jìn)行引物的選擇。從小編設(shè)計(jì)的引物表中看到,最高合成率為88,其對(duì)應(yīng)的左側(cè)表中均出現(xiàn)“Dimer”和“Cross Dimer”,說明此引物不甚理想。最佳的情況為“Hairpin”、“Dimer”、“False Priming”和“Cross Dimer”都不出現(xiàn),也就是100合成率。

08

重新設(shè)置條件如何引物不甚理想,那么就需要重新設(shè)置引物的各個(gè)條件,尤其是“Search Ranges”的選擇,需要我們再次點(diǎn)擊“Search ”,跳出條件設(shè)置界面后重新設(shè)置。

09

選擇理想引物經(jīng)過多次的不斷更改和設(shè)置后,最終選出較為理想的一對(duì)引物,合成率最好在98以上,四種狀況均不出現(xiàn)為好。


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